Hyaluronik Asit Dolgularının klinik kullanımında dikkate alınması gereken önemli parametreler şunlardır:

1. **Çapraz Bağlanma Derecesi**: Dolgunun yapısal özelliklerini belirler.

2. **Çapraz Bağlı ve Çapraz Bağlı Olmayan HA Oranı**: Ürünün monofazik veya bifazik olmasını etkiler.

3. **Dolgu Maddesinin Dokuda Kalma Süresi**: Etkinliğin sürekliliğini gösterir.

4. **G’ (Elastikiyet Yeteneği)**: Bu parametre, dolgunun elastik gücünü ifade eder ve jelin sertliği olarak da tanımlanabilir.

5. **Enjekte Edilebilirlik (Extrusion Force)**: HA yoğunluğu ve akışkanlık özellikleri, uygulama kolaylığını sağlar.

6. **Saklama Koşulları**: Hyaluronik asidin soğukta saklanmasına gerek yoktur; ancak ısıyla temas etmemelidir. Aksi takdirde, oluşan monomerler inflamasyon riski taşır. Son zamanlarda Avrupa'da yapılan bir çalışmada, dolgu etkisinin zamanla azaldığı ve tedavi sonrası ikinci haftada %98, üç ayda %82, altı ayda %69 ve bir yıl sonra %66 oranında azalma görüldüğü bildirilmiştir.

7. **HA Partikül Hacmi**: Hacim doldurma kapasitesini belirler.

8. **Mililitredeki HA Partiküllerinin Yoğunluğu**: Ürünün kalıcılığını ve stabilitesini etkiler.

9. **HA'nın Ödem Yapma Kapasitesi**: İnflamasyon ve endürasyon derecesini gösterir.

10. **Lidokain Varlığı**: Hazırlanan dolgu ürününde lidokain bulunup bulunmadığı.

11. **Kullanılacak İğne ve Boyutu**: Uygulama için tercih edilen iğne türü ve boyutu.

12. **Şırınga ve Tasarımı**: Dolgunun yer aldığı şırınga ve tasarım özellikleri.

Farklı çapraz bağlanma ürünleri, hyaluronik asitlerde farklı oranlarda kullanılmaktadır ve bu ürünlerin HA konsantrasyonları da değişiklik göstermektedir. Bu farklılıklar, ürünlerin klinik kullanımını ve elde edilen sonuçları etkiler. Yüksek biyoteknoloji ile üretilen bu ürünler jel formundadır ve iki ana tipte bulunmaktadır: bifazik ve monofazik.

Bifazik HA

Bifazik HA jel, çapraz bağlanmamış hyaluronik asit (HA) çözeltisi içinde çapraz bağlı HA'nın yer aldığı bir formülasyondur. İlk olarak 1996 yılında geliştirilen ve horoz ibiğinden elde edilen bu HA türleri bifazik özellik taşımaktadır. Daha sonra biyoteknoloji ile bakterilerden biyofermantasyon yoluyla elde edilen ikinci nesil HA'ların bazıları da bifazik olarak üretilmiştir. Bu özellik, bifazik HA ürünlerine yüzey kayganlığı, ince iğnelerle kolay enjekte edilebilme ve dokular arasında rahatça ilerleyebilme avantajı sağlamaktadır. Böylece daha visköz çapraz bağlı HA ürünleri, hedef dokuya daha kolay uygulanabilmektedir; örneğin Restylane ve Perlane (Q-Med, Uppsala, İsveç) gibi ürünler. Restylane partikülleri 250 µm boyutunda ve 100,000 partikül/ml yoğunluğundadır. Perlane ise 550 µm boyutunda olup 8,000–10,000 partikül/ml içermektedir.

Bu HA dolgu maddelerinde çapraz bağlı HA partikülleri farklı boyutlarda bulunmaktadır. Çapraz bağlı HA, asıl dokuda kalıcı olan stabil bir bileşendir. Bu stabil bölüm, dokuda üç boyutlu bir yapı oluşturarak sağlam ve elastik bir form kazandırmaktadır. Bu yapı, dokulara ve kendisine kan akışını engellemeyecek şekilde tasarlanmıştır. Bifazik HA dolgularda, fiziksel olarak içerikteki partiküller daha belirgin olup, yapıları daha heterojendir.

Monofazik HA

Monofazik HA, tek tip çapraz bağlı veya bağsız HA çözeltisi içermektedir. Monofazik dolgularda HA'ler, yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı veya karışık olabilir. Eğer dolgu, aynı yoğunluktaki HA'lerden oluşuyorsa, buna "monofazik monodansite HA" denir. Bu tür dolgular, çapraz bağlar oluşturularak üretilmiştir ve jel yapıları farklı sertlik ve boyutlarda olabilir. Jelin hidrasyonu, kolay enjekte edilebilirliklerini artırır. Juvederm (Allergan Inc., Irvine, CA, ABD) ve Surgiderm (Allergan-Corneal Industry, Pringy, Fransa) bu gruba örnek teşkil etmektedir.

Monofazik dolgularda, ürün içindeki partiküller bifazik dolgulardan daha az belirgin hale gelir. Hafif bir dolgu düzensizliği gözlemlense de, bu durum HA'ler arasındaki çapraz bağlardan kaynaklanmaktadır.

Eğer monofazik dolgu jellerde HA'ler farklı yoğunluklarda ise, buna "monofazik polidansiteli HA" denir. Bu tür dolgularda, ilk olarak çapraz bağlar oluşturulmakta, ardından farklı yoğunluktaki HA'ler eklenerek tekrar çapraz bağlanma sağlanmaktadır. Esthelis Basic (Anteis SA, Geneva, İsviçre) ve Belotero (Merz Aesthetics, Inc., San Mateo, CA, ABD) bu HA grubuna örneklerdir.

Monofazik ve polidansiteli dolgular, bu açıdan diğer iki türden daha homojen bir görünüm sergilemektedir.

Bifazik ve monofazik hyaluronik asit (HA) dolguları, farklı klinik amaçlar için kullanılmaktadır. Bu ürünlerin içindeki HA partikül boyutları, çapraz bağlanma yöntemleri, çapraz bağlanma oranları, serbest HA miktarı, elastik modül (G’) ve su tutma özellikleri (higroskopik denge) değişiklik göstermektedir. Monofazik ve bifazik olmalarının yanı sıra, monofaziklerin mono veya polidansiteli olmaları, dokulardaki davranışlarını etkiler.

Bifazik dolgu maddeleri subdermal alanda uygulandığında, aşağıdaki resimde görüldüğü gibi dokuda büyük boşluklar oluşturmakta ve derideki kollajen bantlarını ayırarak HA havuzları meydana getirmektedir (Restylane uygulama örneği). HA, yalnızca subdermis ve dermisin alt kısımlarında kümeler ve boncuklar şeklinde görünmektedir; üst ve orta dermiste ise bulunmamaktadır.

Aşağıdaki resimde E ve F de monofazik monodansiteli HA(Juvederm Ultra) uygulama sonrası doku histolojisi gösterilmektedir. E ve F de HA retiküler dermis üzerine kadar geçmiş kollajen bantları arasında büyük havuzlar oluşturmuştur. Bunlar bifazik HA dolgulara göre daha büyük ve kollajen fiberlerinin arasına girmiştir. Papiller dermite HA yok. Retiküler dermisin üst 2/3 ünü % 90 nını kaplamış.
Aşağıdaki resimde G ve H, monofazik polidansitel HA (Esthelis Basic) uygulaması sonrası doku histolojisini göstermektedir. Burada HA, subdermis ve retiküler dermis arasındaki kollajen bantları arasında yer almakta ve retiküler dermisin %90'ını kaplamaktadır. Ancak diğerlerinden farklı olarak, retiküler dermiste yalnızca %10'luk bir alanda büyük boşluklar içinde bulunmaktadır. Papiller dermiste ise HA bulunmamaktadır. Bu durum, dokudaki dağılımın ne kadar homojen olduğunu göstermektedir.

Bifazik hyaluronik asit (HA) uygulamaları, monofaziklere kıyasla daha fazla ödem ve ağrıya neden olmaktadır. Bu durum, bifaziklerin dokuda daha büyük havuzlar şeklinde birikmesinden ve kollajen bantlarını iterek yer değiştirmesinden kaynaklanmaktadır. Öte yandan, bifazik HA dolgular, yeni kollajen üretimini daha fazla teşvik etmektedir.

En yaygın kullanılan hyaluronik asit (HA) kaynakları arasında horoz ibiği, insan göbek kordonu, deri, tendon ve bakteri kültürleri bulunmaktadır. HA dolguları iki ana kategoriye ayrılır: hayvan kökenli (örneğin, Hylaform) ve bakteri kökenli (örneğin, Restylane, Juvéderm gibi). Hayvan kökenli olmayan HA'ler, "hayvan dışı kaynaklı sentetik hiyalüronik asit" anlamına gelen NASHA olarak adlandırılmaktadır. Günümüzde HA, bakterilerden biyofermantasyon yöntemiyle üretilmektedir. Bu süreçte, streptokok ve basil olmak üzere iki tür bakteri kullanılmaktadır.

“Streptococcus equi,” hastalıklara neden olan bir mikroorganizmadır. Hyaluronik asit (HA), bu bakterinin hücresel duvarı ve hücre kapsülünden elde edilmektedir. Üretim sürecinde, elde edilen HA, organik solventler kullanılarak bakteriden ayrılmaktadır. Bu nedenle, streptokok kaynaklı HA'larda ürün içinde bakteriye ait endotoksinler ve solvent kalıntıları bulunabilir. Ayrıca, elde edilen HA molekülleri farklı uzunluk ve ağırlıklara sahip olduğundan homojen değildir. Bu durum, 2000'li yıllardan önce üretilen HA'ların hastalarda %0.8 oranında aşırı duyarlılıklara yol açmasına neden olmuştur. Ancak, ürün geliştirme sürecinde yapılan iyileştirmelerle, bu oran 2000'li yıllardan sonra %0.6'ya kadar düşmüştür.

Son yıllarda, bu olumsuzlukları gidermek amacıyla 2011 yılında “Bacillus subtilis” bakterisinden HA elde edilmiştir. Bacillus subtilis, normalde toprakta bulunan ve bazı hayvanların sindirim sisteminde yer alan bir bakteridir. Bu bakteriden elde edilen HA, hücre içinde sentezlenip dış ortama salgılanmaktadır; dolayısıyla streptokoklarda olduğu gibi solvent kullanılmamaktadır. Organik solventler, hem üretim maliyetini artırmakta hem de HA'nın moleküler yapısında değişikliklere yol açmaktadır. Bacillus subtilis'ten elde edilen HA, daha homojen bir yapıya sahiptir.

Doğal formundaki HA, ciltte bulunan hyaluronidaz enzimi, kasların mekanik etkisi ve serbest oksijen radikalleri tarafından hızla parçalanmakta ve emilmektedir. Derideki yarılanma ömrü 24 saatten azdır ve parçalanarak karaciğerden atılmaktadır. Vücutta her gün HA'nın %30'u yenilenmektedir.

Normal bir hyalüronik asit molekülü, insan derisine enjekte edildikten 12 saat içinde metabolize edilerek vücuttan atılır. Bu nedenle, kalıcılığını artırmak için HA moleküllerinde çapraz bağlar kullanılır. Hyaluronik asidin çapraz bağlanması, çözeltinin daha visköz olmasını sağlar ve su içinde çözünmez hale getirir.

Hyaluronik asit (HA) kimyasal çapraz bağlar, hidroksil ve karboksil grupları arasında oluşturulmaktadır. Bu işlem için genellikle iki kimyasal madde kullanılmaktadır: 1,4-butanediol diglikidil eter (BDDE), Restylane, Juvéderm, Teosyal ve Varioderm gibi ürünlerde yer alırken; divinyl sulfone (DVS) ise Hylaform, Prevelle Lift, Varioderm Plus ve Varioderm Subdermal'da kullanılmaktadır.

HA polimer zincirleri arasında çapraz bağların oluşumu, üç boyutlu büyük ağ yapıları meydana getirir. Ancak bu büyük jel formları dermal dolgu olarak kullanılamaz; enjekte edilebilmeleri için daha küçük yapılara ayrılmaları gerekmektedir. Bazen, çapraz bağlı dolgu maddelerine çapraz bağsız HA eklenir; bu, enjeksiyonun kayganlığını artırarak uygulamayı kolaylaştırır.

HA dolgularındaki çapraz bağlanma oranı, HA partikül boyutlarını ve dokuda su tutma kapasitesini, yani ödem yapma potansiyelini etkiler. Çapraz bağlanma, dolguya yeni özellikler kazandırır ve bu özellik, "modifikasyon derecesi" (degree of modification, MoD) olarak adlandırılır. MoD, çapraz bağ oluşturan kimyasal moleküllerin sayısının, HA'yı oluşturan disakkarid moleküllerinin sayısına oranı ile hesaplanır. Bu değer, HA'nın uygulandığı dokudaki biyolojik uyumunu gösterir.

HA'daki çapraz bağlar, ayrıca HA jelinin lifting gücünü de artırır. Ayrıca, HA moleküllerinin iç ve dış kuvvetlere karşı modifiye olabilme kapasitesini yansıtır. Modifikasyon derecesi ne kadar düşükse, biyolojik uyumluluk ve kuvvetlere karşı direnç o kadar yüksek olur.

MoD ölçümü, HA içeren dolgu jelinin %0.9 NaCl ile yıkanması ve 0.22 mikron filtrelerden geçirilmesi ile başlar. Ardından, Chondroitinase AC enzimi ile işleme tabi tutulur ve 1H NMR cihazında ölçümler yapılır. Bu sistem, HA'daki N-asetil grupları ve BDDE gibi çapraz bağlardan sinyal alır; bu sinyallerden MoD hesaplanır.

Bir diğer önemli kavram ise "modifikasyon verimliliği" (modification efficiency, MoE)dir. Bu, aşağıdaki formül ile hesaplanır ve yüksek bir değer, biyolojik uyumluluğun ve dolgunun modifikasyona karşı direncinin iyi olduğunu gösterir.

Cmin, yoğun bir çözücü içinde HA'nın tam şişebilmesi için gerekli olan konsantrasyonu ifade eder ve mg/ml cinsinden ölçülür. Güçlü jeller az şişer ve yüksek Cmin değerine sahiptir. Bu nedenle, dolgu jelinin HA içeren kısmı ayrılır ve jel 0.22 mikron filtrelerden geçirilir. Elde edilen HA'nın başlangıçtaki hacmi V0 olarak tanımlanır. Daha sonra bu HA, %0.9 NaCl içine konulur ve tam şişmesi beklenir. Tam şişme hacmi V olarak tanımlanır ve V/V0 oranı Cmin değerini verir.

Tüm bu kimyasal işlemlerin amacı, HA molekülünde modifikasyon yaratarak dokudaki etkinliğini ve kalış süresini artırmaktır. HA'deki kimyasal modifikasyonlar, moleküler yapısındaki üç fonksiyonel gruba odaklanmaktadır: glukuronik asit, karboksilik asit, primer ve sekonder hidroksil grupları ile N-asetil grubu. En sık olarak karboksilik asit üzerinde modifikasyon yapılmaktadır.

Bu modifikasyon ile yeniden geliştirilen HA, iki ana kategoriye ayrılmaktadır.

1. **Monolitik HA'ler**: Bu formlar, dokuya uygulandıklarında doku ve hücrelerle yeni kimyasal bağlar oluşturmayan HA türleridir.

2. **Living HA'ler**: Bu formlar, dokuya uygulandıklarında doku, hücre ve hatta ilaçlarla yeni kovalent bağlar oluşturan HA türleridir.

Örneğin, BDDE ile çapraz bağlar oluşturularak modifiye edilen HA, monolitik modifiye HA olarak sınıflandırılır.

Yukarıdaki resimde, HA molekülünde kimyasal çapraz bağlarla yapılan modifikasyonlar gösterilmektedir. Modifiye HA molekülünün sonunda, modifikasyona uğramamış bir disakkarit ünitesi yer almaktadır. Bu bölümde, disulfid, hidrazid ve enzimatik reaksiyonlar gibi kimyasal reaksiyonlara ihtiyaç duyulmadan işlemler gerçekleştirilmektedir.

Çapraz bağlı HA'lerin uygulama alanındaki kalıcılığı, dolgunun elastikliği ve konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bu bilgi doğrultusunda, son yıllarda sodyum karboksimetilsellülöz (CMC) ve polietilen okisid (PEO) gibi iki sentetik polimer, HA yerine alternatif olarak değerlendirilmiş ve HA dolgularıyla karşılaştırılmıştır. CMC ve PEO, ilaç ve kimyasal aletlerde kullanılmaktadır. Laresse dolgularında her iki polimer de yer almaktadır. (Laresse; FzioMed, Inc., San Luis Obispo, CA, ABD)

Kimyasal formülü C14H21NO11 olan bu bileşik, tekrarlayan D-glukuronik asit ve D-N-asetik-glukozamin dimerik ünitelerinden oluşan, sulfur içermeyen bir glikozaminoglikandır. Moleküller, β-1,4 ve β-1,3 glikozid bağları ile birbirine bağlıdır ve bu yapılar, hyaluronik asit (HA) molekülü boyunca tekrarlanmaktadır.

HA, bu kimyasal yapısıyla bir polimer oluşturur ve bu polimerin boyutu 5,000 ile 20,000,000 Dalton arasında değişir. İnsan vücudundaki HA boyutları, bulunduğu anatomik alana göre farklılık gösterir. Örneğin, eklemlerdeki sinoviyal sıvıda HA boyutu 3-4 milyon Dalton iken, göbek kordonunda 3,140,000 Daltondur.

Ayrıca, HA yapısında silikon da bulunmaktadır. Silikon içeriği, vücudun anatomik alanına bağlı olarak değişir ve 350 μg/g ile 1900 μg/g arasında değişiklik gösterir.