Kaslar ve ter bezlerinin işlevleri, sinir sistemi tarafından asetilkolin ve benzeri mediyatörler aracılığıyla kontrol edilir. Botulinum toksininin etki mekanizması, asetilkolin salınımını engelleyerek gerçekleşir ve bu süreç oldukça iyi bilinmektedir. Toksin, ağır ve hafif molekül zincirlerinden oluşan bir yapıya sahiptir. Toksin dokuya uygulandığında, ağır zincir kısmı nöromüsküler kavşağın presinaptik ucuna seçici ve geri dönüşümlü bir şekilde bağlanır ve sinir hücresine endositoz yoluyla girer. Bu aşamada hafif zincir, ağır zincirden ayrılır. Ardından, asetilkolin salgılanmasında rol oynayan spesifik protein zarlarına tutunarak dokular arasında yayılır. Bu süreç, nöromüsküler kavşakta asetilkolinin salınımını hemen inhibe eder ve böylece kasların geçici olarak gevşemesine veya ter bezlerinin geçici olarak çalışmasını engeller.

Bu etkiler genellikle toksin enjeksiyonundan 24 saat sonra başlar ve yaklaşık iki hafta içinde belirginleşir. Toksinin etkisi geçicidir ve yaklaşık 3-6 ay boyunca devam eder; ancak bu süre, kişiye ve uygulanan kas grubuna göre değişiklik gösterebilir.

Toksinin dokuda etki mekanizması dört ana adımda gerçekleşir:

1. İlk adım, toksinin ağır zincirinin presinaptik sinir hücrelerinin yüzeyindeki spesifik reseptörlere bağlanmasıdır. Bu süreç yaklaşık 30 dakika sürer.

2. İkinci adım, reseptör aracılı toksinin sinir hücresine girişi olan endositoz sürecidir. Bu aşamada, sinir hücresi plazma zarı, toksin-reseptör kompleksinin etrafında kıvrılarak sinir terminalinde toksin yüklü veziküller oluşturur.

3. Üçüncü adım, translokasyondur. Veziküller içerisindeki toksinin hafif ve ağır zincirleri arasındaki disülfür bağı kopar ve hafif zincir, veziküllerin endosomal membranına geçerek sinir terminalinin sitoplazmasına salınır.

4. Son adım ise blokajdır. Botulinum toksinin serotip A ve E hafif zincirleri, sinir terminallerindeki asetilkolin veziküllerinin sitoplazmik bir proteini (SNAP-25) keserek asetilkolinin presinaptik boşluğa salınımını engeller. Sinir sonlanmasında, hücre içinde veziküllerde SNARE (snaptobrevin olarak da bilinir) proteini ve hücre membranında iki hedef protein (SNAP-25 ve syntaxin) bulunur. Son araştırmalar, hafif zincirin bu kompleks yapıyla etkileşime girdiğini göstermektedir. Örneğin, botulinum toksin A ve B, SNAP-25 ile; botulinum toksin B, D ve F ise SNARE ile; botulinum toksin C ise SNAP-25 ve syntaxin ile etkileşimde bulunur.

Botulinum toksini, sinir uçlarındaki SNARE kompleksini engelleyerek asetilkolin salınımını durdurur. Bu durum, sinir dokusu üzerindeki etkisini azaltır veya tamamen ortadan kaldırır. Düşük dozlarda bile etkisi gözlemlenebilir; ancak doz artırıldığında kas üzerindeki etki artmaz. Belirli dozlarda ve düzenli aralıklarla çizgili kaslara uygulandığında, botulinum toksini kas atrofisine yol açabilir. Toksin, düz kaslar üzerinde de benzer etkiler gösterir. Ayrıca, asetilkolin aracılığıyla ter, gözyaşı ve tükürük bezleri üzerinde de etkilidir. Toksinin dozu, etki süresiyle doğrudan ilişkilidir. Örneğin, koltuk altı aşırı terleme tedavisinde 10 ünite altında yapılan uygulamalar, etki süresinin 3 aydan kısa olmasına neden olurken; 50-100 ünite uygulandığında bu süre 9-12 aya, 200 ünite uygulandığında ise 15 aydan uzun sürmektedir. Frey sendromunda daha düşük dozlar, uzun etki süresi sağlamak için yeterli olmaktadır. Botulinum toksini, kas-sinir sistemi kaynaklı ağrılarda da etkilidir ve benzer bir etkiyle kronik kaşıntıyı azaltabilir.

Yüzdeki kırışıklıkların çoğu, mimik kaslarının sürekli kasılmasından kaynaklanır. Botulinum toksini kaslara uygulandığında, sinir uyarılarını kısmen engelleyerek aşırı kasılmayı azaltır ve bu kaslarda geçici bir zayıflama meydana getirir. Mimik kaslarına uygulandığında, yüz ifadesini bozmadan sadece deri kırışıklıklarının oluşumunu engeller. Uygulama yapılacak hasta ve alanın seçimi ile uygulanacak dozlar son derece önemlidir; bu nedenle toksin mutlaka uzman bir doktor tarafından uygulanmalıdır.